Recherche de virus

Le risque de contamination virale se situe principalement à trois niveaux :

• celui des denrées alimentaires commercialisées et des eaux de boisson dont l’innocuité est évaluée en amont, dans le cadre d’une réglementation,
• celui du cadre professionnel, lui aussi soumis à une réglementation spécifique (Directive 2000/54/EC biological agents at work),
• celui des évènements auxquels tout individu est soumis au quotidien, accidentel ou pas (échanges directs de liquides biologiques entre humains, accidents impliquant des milieux contaminés ou des animaux sauvages, etc…).

Outre les contacts directs, les principales sources de contamination virale sont la voie atmosphérique, et la voie alimentaire lorsque des denrées ou l’eau de boisson, ont été en contact direct ou indirect avec des matières fécales. Les contrôles portent donc essentiellement sur les virus entériques humains (VEH) et plus particulièrement sur trois groupes :

• les norovirus responsables de la plupart des gastroentérites (diarrhées, vomissements, peines abdominales)
• les virus des hépatites A et E (inflammation du foie)
• les rotavirus caractéristiques des gastroentérites chez les enfants

Parmi les infections, la voie alimentaire est privilégiée du fait des manipulations (essentiellement humaines) que les denrées subissent en amont de leur distribution et du fait qu’elles réunissent, pour la plupart, des conditions favorables au maintien de l’intégrité des virus (et donc de leur caractère infectieux),.

Par ailleurs, de nombreuses publications scientifiques (Lee et al, 2014, López-Gálvez et al, 2016, Opere et al, 2020,) mettent en évidence l’importante circulation des virus entériques dans l’environnement, plus particulièrement dans les environnements aquatiques et en grande majorité en aval de rejets de stations d’épuration.

L’analyse de ces résultats au plan de l’évaluation des risques pour la santé humaine, doit cependant être nuancée par le fait :

• que dans beaucoup d’études, la détection des VEH est celle de leur génome, ce qui ne rend pas compte de leur caractère infectieux.
• que les études qui traitent de cet aspect le font par l’intermédiaire d’organismes de substitution (phages, norovirus murin) et ne sont donc pas aisément transposables aux populations humaines.

En résumé, la fréquence des gastroentérites semble être expliquée à la fois par une certaine résistance des VEH aux conditions environnementales et à beaucoup des traitements couramment mis en place dans l’industrie agroalimentaire, mais aussi du fait de leur faible dose infectieuse.

La recherche d’un virus peut être réalisée pour le danger qu’il représente, mais aussi en tant qu’indicateur direct ou indirect d’une contamination fécale. Les coliphages somatiques, par exemple, sont recherchés en tant qu’indicateur de la présence d’une bactérie, Escherichia coli, elle-même indicatrice du contact de l’eau analysée avec une eau usée.

L’un des classements qui sont faits des analyses de virus distingue trois catégories :

• celles qui s’adressent à leur infectivité qui impliquent une culture sur milieu solide ou liquide. Plusieurs modes de lecture des résultats sont utilisés : TCID50, immunofluorescence.
• celles qui s’adressent à leurs constituants, acides nucléiques ou protéines (qPCR, immunoblotting, immuno précipitation, ELISA, hémagglutination)
• les dénombrements directs dans lesquels les virus sont considérés en tant que particules (cytométrie en flux, microscope électronique à transmission)

Les analyses se distinguent également selon la phase du protocole à laquelle elles participent :

• phase d’extraction et de concentration des virus à partir du milieu analysé (filtration, précipitation-centrifugation, etc…)

• phase d’analyse proprement dite de l’extrait (plages de lyse, biologie moléculaire, microscopie, etc…)

Du fait du temps que nécessite leur mise en œuvre et du coût du matériel nécessaire, certaines de ces techniques relèvent plus des laboratoires de recherche que des laboratoires d’analyse.

Ce type d’analyses comporte trois étapes :

• l’extraction et la concentration des virus du milieu analysé
• la lyse des virus pour en extraire les acides nucléiques (ARN ou ADN, selon les virus)
• l’analyse moléculaire proprement dite des extraits : qPCR (virus à ADN) ou RT-qPCR (virus à ARN)

Phase d’extraction des virus.

Le laboratoire ABIOLAB met en œuvre deux techniques d’extraction et de concentration des virus : la filtration sur cartouche filtrante électropositive, et une technique associant élution, précipitation et centrifugation. L’efficacité de l’extraction varie dans de larges mesures en fonction de la composition de l’eau analysée. Cette étape reste le principal point faible des protocoles avec des rendements d’extraction parfois très faibles (<10%). Elle fait l’objet d’une partie des travaux de la cellule R&D du laboratoire.

Phase de détection et de quantification des acides nucléiques (qPCR ou RT-qPCR).

qPCR est l’abréviation de « quantitative Polymerase Chain Reaction ». Cette technique a pour objectif de multiplier les chaines d’ADN ou d’ARN qui ont été extraites de l’échantillon à analyser (où elles se trouvent, a priori, en petite quantité), pour que leur concentration dépasse le seuil de sensibilité du dispositif de mesure.

Les mécanismes naturels de la multiplication des acides nucléiques, sont reproduits in vitro, dans des plaques à puits dans lesquelles les composés suivants sont mis en contact :

• une quantité non limitante des 4 nucléotides qui composent les acides nucléiques
• une ADN polymérase thermorésistante (Taq polymérase) pour la catalyse de la synthèse
• des oligonucléotides appelés amorces qui encadrent la séquence qui doit être amplifiée, l’amplicon.
• dans la technique dite Taqman, une séquence susceptible de s’apparier dans cette même région, sur laquelle ont été greffés un reporter fluorescent et un composé suppresseur de fluorescence (quencher). A chacun des cycles d’amplification, les nucléotides qui composent cette sonde sont dissociés. Il en résulte la séparation du quencher et du reporter. Ce dernier émet alors un signal de fluorescence sous l’effet d’un rayonnement UV (Figure 1). L’amplitude de ce signal augmente donc proportionnellement avec le nombre de cycles. La valeur finale enregistrée, le Ct (Cycle threshold) est celle du nombre de cycles nécessaires (et donc le nombre d’amplicons produits) pour que le signal se situe au-dessus du bruit de fond de l’appareil, en début de phase exponentielle. Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre ce seuil est donc inversement proportionnel au nombre d’occurrences de la séquence considérée, dans l’échantillon initial. Les résultats de l’amplification apparaissent en temps réel sur l’écran du thermocycleur d’où le nom de qPCR en temps réel donné à cette technique.

Dans le cas où la séquence à amplifier est de l’ARN, sa transcription en ADN dit complémentaire (ADNc) est nécessaire pour garder le bénéfice de l’utilisation de l’ADN polymérase (les ARN polymérases ne présentent pas les mêmes intérêts sur le plan réactionnel). Le mélange de départ doit donc contenir l’enzyme correspondant, la transcriptase reverse. De qPCR, la technique devient une RT-qPCR (Reverse Transcription quantitative Polymerase Chain Reaction), dans laquelle l’abréviation RT pourrait être répétée pour sa seconde signification, la dénomination complète de la technique étant « Reverse Transcription Real Time quantitative Polymerase Chain Reaction ».

Les plaques à puits sont installées dans un thermocycleur où elles sont soumises à des variations de température dont l’amplitude et la durée correspondent aux conditions optimales des étapes successives de la synthèse. Les réactions se produisent spontanément sous le contrôle de ces cycles de température. Le cycle est répété jusqu’à ce que le signal de fluorescence atteigne une phase plateau (Figure 1).

Figure 1. Exemple de graphique produit par un thermocycleur

2 – Techniques basées sur le caractère infectieux des virus

Elles sont utilisées plus particulièrement dans le cadre des travaux de recherche du laboratoire.

Lecture par la technique des plages de lyse

Dans ces techniques, des cellules, sensibles à l’infection du virus considéré, sont cultivées dans des flacons plats ou des boites de Pétri, jusqu’à ce qu’elles soient confluentes. Un volume connu (l’inoculum) de plusieurs dilutions de l’échantillon à analyser est déposé en plusieurs endroits du tapis cellulaire. Après un temps d’incubation, les zones dans lesquelles la concentration des virus a été suffisante pour provoquer la lyse des cellules, apparaissent sous la forme de cercles plus clairs (par comparaison au fond cellulaire intact). Ces zones sont appelées plages de lyse (Fig. 2). La concentration initiale de l’échantillon est calculée en faisant l’hypothèse de la présence d’au moins une particule virale dans la dilution la plus grande.

Lecture par appréciation visuelle de l’attaque virale. 

La TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose) est une forme d’expression du titre d’une suspension virale. Il s’agit de la concentration d’un inoculum pour laquelle 50% des cellules d’une culture infectée ont manifestement été affectées (effet cytopathique ou destruction) par le virus.

La lecture est visuelle (éclaircissement de la culture). Elle peut être automatisée si la culture a été faite en puits, à l’aide d’un dispositif néphélométrique.

Le laboratoire Normec Abiolab a fait de la virologie l’un de ses pôles de compétence, à l’appui de l’association ASPOSAN. Cette orientation, maintenant reconnue, s’est traduite par la signature de plusieurs contrats de collaboration avec deux universités voisines (Université Grenoble Alpes et Université Savoie Mont Blanc) et avec la Région Rhône Alpes Auvergne. Deux doctorats sont actuellement en préparation dans ce cadre.Les travaux de la cellule R&D sont orientés vers l’amélioration des techniques d’extraction et de concentration des virus à partir des eaux environnementales et vers sur la recherche de techniques innovantes dans ce domaine. Ils visent également à mesurer et à mieux comprendre l’effet sur les charges virales, des différentes étapes du traitement des eaux usées dans les stations d’épuration.

Zárate S, Taboada B, Yocupicio-Monroy M, Arias CF. Human Virome. Arch Med Res. 2017 Nov;48(8):701-716.

Opere WM, John M, Ombori O. Occurrence of Enteric Viruses in Surface Water and the Relationship with Changes in Season and Physical Water Quality Dynamics. Adv Virol. 2020.

López-Gálvez F, Truchado P, Sánchez G, Aznar R, Gil MI, Allende A. Occurrence of enteric viruses in reclaimed and surface irrigation water: relationship with microbiological and physicochemical indicators. J Appl Microbiol. 2016.

Chang Soo Lee, Cheonghoon Lee, Jason Marion, Qiuhong Wang, Linda Saif, Jiyoung Lee. Occurrence of human enteric viruses at freshwater beaches during swimming season and its link to water inflow, Science of The Total Environment,472, 2014: 757-766.